thumb|(A) Een enkel Mycobacterium smegmatis porin A (MspA) kanaal wordt in een lipide dubbellaag membraan ingevoegd. K+-ionen en Cl--ionen bevinden zich aan beide zijden van het membraan. Een aangelegd elektrisch veld drijft K+-ionen van een zijde van het membraan naar het andere en Cl-ionen omgekeerd door MspA heen. (B) Hier ontwindt het motorenzym het dubbelstrengs DNA (dsDNA) en remt daarmee de translocatie af, waardoor de doorgang van het ssDNA verder in de porie stap voor stap mogelijk wordt. De stroom van zowel K+- als Cl--ionen wordt gemoduleerd door de aanwezigheid van het DNA in de porie.Nanopore sequencing is een laboratoriumtechniek waarmee de sequentie van verschillende biopolymeren, zoals DNA, RNA en ook eiwitten, gelezen kan worden met gebruik van zeer fijne poriën die afmetingen van een nanometer bezitten.
In nanopore sequencing zijn de poriën ingebed in een membraan en het geheel bevindt zich in een electrolytoplossing. De poriën bestaan uit synthetische kanalen of biologische eiwitkanalen, porines genaamd. Nadat er elektrische stroom toegepast wordt stromen de ionen door de porine. Wanneer vervolgens DNA, waarvan de sequentie bepaald dient te worden, ook door het kanaal van de porine passeert, worden er veranderingen in elektrische stroom waargenomen al naar gelang de nucleotide die door de porie heengaat. Elk van de vier nucleotiden produceert een karakteristieke variatie in de ionenflux zodat de sequentie van nucleotiden direct gelezen kan worden.
De techniek wordt gerekend tot de vierde generatie sequentie-technieken. Een enkel molecuul van DNA is genoeg en hoeft niet met PCR geamplificeerd te worden. Er wordt geen gebruik gemaakt van kleurtechnieken en de techniek kan in allerlei situaties ingezet worden. De kleine apparaten die daar sinds 2019 voor beschikbaar zijn bieden de mogelijkheid om tegen relatief lage kosten sequenties te lezen. Dit kan op bijna iedere gewenste plaats, met een snelle verwerking van monsters en de mogelijkheid om per direct resultaten weer te geven. Een belangrijke toepassing is het identificeren van pathogenen en bijbehorende infectieziekten.
Ontwikkeling thumb|De draagbare sequencer, MinION, wordt voorbereid voor het sequencen|linksIn 1996 werd de eerste translocatie van een polynucleotide (een poly-U, bestaand uit uitsluitend Uracil) uitgevoerd met als porie α-hemolysine (αHL) van stafylokokken. De strengen nucleotiden verplaatsten zich echter te snel door het kanaal van de porie waardoor de signalen niet onderscheiden konden worden en de resolutie slecht was. Dit is verbeterd door het gebruik van enzymen die dubbelstrengs DNA (dDNA) ontwinden. Alleen enkelstrengs DNA (ssDNA) kan door de porie passeren. Het ontwinden, dat daaraan vooraf gaat en dat tijd kost, vertraagt de translocatie waardoor de nucleotiden stap voor stap passeren en de resolutie verbetert. Het is inmiddels mogelijk DNA te sequentiëren met behulp van een apparaat zo klein als een mobiele telefoon, de MinION. Deze worden ontwikkeld door het bedrijf Oxford Nanopore Technologies dat samen met academici opgezet is. Deze kleine apparaten zijn nagenoeg overal inzetbaar. Voor forensisch onderzoek zijn ze nog niet betrouwbaar genoeg.
Principe
thumb|Principe van Nanopore sequencing. Terwijl het ssDNA de porie doorgaat kan het resultaat gelezen worden als een reeks elektrische signalen die de sequentie van nucleotiden vertegenwoordigen.De techniek is in eerste instantie ontwikkeld voor het sequentiëren van DNA. Vervolgens is er ook onderzoek gedaan naar het sequentiëren van eiwitten waar onder andere de groep van Cees Dekker veel aan gewerkt heeft. De technieken baseren zich allemaal op een electrolytoplossing aan weerszijde van een membraan. De nanopore sequencing kan uitgevoerd worden met een porie in een kunstmatige plaat of met een biologische porine in een membraan dat bestaat uit een lipide dubbellaag.
Zodra er elektrische spanning gezet wordt op het membraan, gaan de ionen door het kanaal van de nanopore stromen. Elke verstoring van deze stroom kan gedetecteerd worden. Beweegt zich een DNA-streng door het kanaal, dan kan elke nucleotide die passeert een specifieke kenmerkende verstoring voortbrengen en kan de sequentie van verstoringen aangeven om welke sequentie van de vier nucleotiden het gaat. Hetzelfde geldt voor eiwitten die echter uit twintig verschillende aminozuren opgebouwd kunnen zijn. Het determineren van de sequentie van een eiwit wordt daardoor bemoeilijkt. Het type signaal dat resulteert is afhankelijk van de grootte, de vorm, de lading en specifieke interacties van de proteïne met de porie.
Toepassingen Nanopore sequencing heeft vele toepassingen in de bevordering van de menselijke gezondheid. Enkele voorbeelden zijn:
Het opsporen en identificeren van pathogenen waarin de techniek bijvoorbeeld een grote rol had in de identificatie en het sequentiëren van SARS-CoV-2 gedurende de coronapandemie. Het is met de draagbare nanopore sequencer mogelijk om zelfs onderscheid te maken tussen cytosine met en zonder een methylgroep wat het mogelijk maakt epigenetische veranderingen op te sporen. In kankeronderzoek is het met de draagbare nanopore sequencer mogelijk biopsieën direct te analyseren en kan het transcriptoom bepaald worden. In de landbouw zijn structurele variatie-genen (SVs) opgemerkt ofwel grote verschillen als deleties, inserties en duplicaties in de genen, die bepalend zijn voor verschillende kenmerken van planten. Ze hebben het mogelijk gemaakt planten als de tomaat te verbeteren voor wat betreft de afmeting, hoeveelheid en smaak van de vrucht.
Zie ook
Sequencing DNA-sequencing
Categorie:Nanotechnologie Categorie:Biologie